實驗室技術(shù)操作要求
一、 無菌操作要求
食品微生物實驗室工作人員,必須有嚴(yán)格的無菌觀念,許多試驗要求在無菌條件下進(jìn)行,主要原因:一是防止試驗操作中人為污染樣品,二是保證工作人員安全,防止檢出的致病菌由于操作不當(dāng)造成個人污染。
1. 接種細(xì)菌時必須穿工作服、戴工作帽。
2. 進(jìn)行接種食品樣品時,必須穿專用的工作服、帽及拖鞋,應(yīng)放在無菌室緩沖間,工作前經(jīng)紫外線消毒后使用。
3. 接種食品樣品時,應(yīng)在進(jìn)無菌室前用肥皂洗手,然后用75%酒精棉球?qū)⑹植粮蓛簟?o:p>
4. 進(jìn)行接種所用的吸管,平皿及培養(yǎng)基等必須經(jīng)消毒滅菌,打開包裝未使用完的器皿,不能放置后再使用,金屬用具應(yīng)高壓滅菌或用95%酒精點(diǎn)燃燒灼三次后使用。
5. 從包裝中取出吸管時,吸管尖部不能觸及外露部位,使用吸管接種于試管或平皿時,吸管尖不得觸及試管或平皿邊。
6. 接種樣品、轉(zhuǎn)種細(xì)菌必須在酒精燈前操作,接種細(xì)菌或樣品時,吸管從包裝中取出后及打開試管塞都要通過火焰消毒。
7. 接種環(huán)和針在接種細(xì)菌前應(yīng)經(jīng)火焰燒灼全部金屬絲,必要時還要燒到環(huán)和針與桿的連接處,接種結(jié)核菌和烈性菌的接種環(huán)應(yīng)在沸水中煮沸5min,再經(jīng)火焰燒灼。
8. 吸管吸取菌液或樣品時,應(yīng)用相應(yīng)的橡皮頭吸取,不得直接用口吸。
二、無菌間使用要求
1. 無菌間通向外面的窗戶應(yīng)為雙層玻璃,并要密封,不得隨意打開,并設(shè)有與無菌間大小相應(yīng)的緩沖間及推拉門,另設(shè)有0.5
2. 無菌間內(nèi)應(yīng)保持清潔,工作后用2%-3%煤酚皂溶液消毒,擦拭工作臺面,不得存放與實驗無關(guān)的物品。
3. 無菌間使用前后應(yīng)將門關(guān)緊,打開紫外燈,如采用室內(nèi)懸吊紫外燈消毒時,需30W紫外燈,距離在
4. 處理和接種食品標(biāo)本時,進(jìn)入無菌間操作,不得隨意出入,如需要傳遞物品,可通過小窗傳遞。
5. 在無菌間內(nèi)如需要安裝空調(diào)時,則應(yīng)有過濾裝置。
三、消毒滅菌要求
微生物檢測用的玻璃器皿、金屬用具及培養(yǎng)基、被污染和接種的培養(yǎng)物等,必須經(jīng)滅菌后方能使用。
(一)干熱和濕熱高壓蒸氣鍋滅菌方法
1.滅菌前準(zhǔn)備
(1)所有需要滅菌的物品首先應(yīng)清洗晾干,玻璃器皿如吸管、平皿用紙包裝嚴(yán)密,如用金屬筒應(yīng)將上面通氣孔打開。
(2)裝培養(yǎng)基的三角瓶塞,用紙包好,試管蓋好蓋,注射器須將管芯抽出,用紗布包好。
2.裝放
(1)干熱滅菌器:裝放物品不可過擠,且不能接觸箱的四壁。
(2)大型高壓蒸氣鍋:放置滅菌物品分別包扎好,直接放入消毒筒內(nèi),物品之間不能過擠。
3.設(shè)備檢查
(1)檢查門的開關(guān)是否靈活,橡皮圈有無損壞,是否平整。
(2)壓力表蒸氣排盡時是否停留在零位,關(guān)好門和蓋,通蒸氣或加熱后,觀察是否漏氣,壓力表與溫度計所標(biāo)示的狀況是否吻合,管道有無堵塞。
(3)對有自動電子程序控制裝置的滅菌器,使用前應(yīng)檢查規(guī)定的程序,是否符合于進(jìn)行滅菌處理的要求。
4.滅菌處理
(1)干熱滅菌法:此法適應(yīng)于在干熱情況下,不損壞、不變質(zhì)、不蒸發(fā)的物品、較常用于玻璃器皿、金屬制品、陶瓷制品等的滅菌。
a. 器械器皿應(yīng)清洗后再干烤,以防附著在表面的污物炭化。
b. 滅菌時安放物品不能過擠,不要直接接觸底和箱壁,物品之間留有空隙。
c.滅菌時將箱門關(guān)緊,接上電源,先將排氣孔打開約30min,排除滅菌器中的冷空氣,溫度升至
d.滅菌完畢后或溫度升溫過程中,須在
(2) 手提式高壓鍋或立式壓力蒸氣滅菌器的使用應(yīng)按下列步驟進(jìn)行:
a. 手提式高壓鍋在主體內(nèi)加入
b. 手提式壓力鍋將頂蓋上的排氣管插入消毒桶內(nèi)壁的方管中(無軟管或軟管銹蝕破裂的滅菌器不得使用)。
c. 蓋好頂蓋擰緊,勿使漏氣;置滅菌器于火源上加熱,立式壓力鍋通上電源,并打開頂蓋上的排氣閥放了冷氣(水沸騰后排氣10-15min)。
d. 關(guān)閉排氣閥,使蒸氣壓上升到規(guī)定要求,并維持規(guī)定時間(按滅菌物品性質(zhì)與有關(guān)情況而定)。
e. 達(dá)到規(guī)定時間后,對需干燥的物品,立即打開排氣閥排出蒸氣,待壓力恢復(fù)到零時,自然冷卻至
(3) 臥式壓力鍋蒸氣滅菌器的使用按下列步驟進(jìn)行:
a. 關(guān)緊鍋門,打開進(jìn)氣閥,將蒸氣引入夾層進(jìn)行預(yù)熱,夾層內(nèi)冷空氣經(jīng)阻氣器自動排出。
b. 夾層達(dá)到預(yù)定溫度后,打開鍋室進(jìn)氣閥,將蒸氣引入鍋室,鍋室內(nèi)冷空氣經(jīng)鍋室阻氣器自動排出。
c. 待鍋室達(dá)到規(guī)定的壓力與溫度時,調(diào)節(jié)進(jìn)氣閥,使保持恒定至規(guī)定時間。
d. 自然或人工降溫至
e.使用自動程序控制式壓力蒸氣滅菌器,在放好物品關(guān)緊門后,應(yīng)根據(jù)物品類別按動相應(yīng)開關(guān),以便按要求程序自動進(jìn)行滅菌,滅菌時必須利用附設(shè)儀表記錄溫度與時間以備查,操作要求應(yīng)嚴(yán)格按照廠家說明書進(jìn)行。
5.滅菌溫度與時間
(1) 干熱滅菌器滅菌溫度
(2) 壓力蒸氣滅菌鍋滅菌溫度與時間見表34-1。
表34-1
(二)間歇滅菌方法
1.滅菌方法系利用不加壓力的蒸氣滅菌,某些物質(zhì)經(jīng)高壓蒸氣滅菌容易破壞,可用此法滅菌。
(1)將欲滅菌物品置于鍋內(nèi),蓋上頂蓋,打開排水口,使器內(nèi)余水排盡。
(2)關(guān)閉排水口,打開進(jìn)氣門,根據(jù)需要消毒10~20min.
(3)滅菌完畢關(guān)閉進(jìn)氣門,取出物品待冷至室溫溫度,放入
2.血清凝固器使用方法,培養(yǎng)基中含有血清或雞蛋特殊成份時,因高熱會破壞其營養(yǎng)成份,故用低溫,可使血清凝固,又可達(dá)到滅菌目的。
(1)在使用該法滅菌的血清等分裝時,需嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作,試管、平皿也經(jīng)滅菌后使用。
(2)將培養(yǎng)基按要求使成斜面或高層,加足水后,接上電源,升溫75~90℃1h滅菌,放
3. 煮沸消毒:可用煮鍋或煮沸消毒器,水沸騰后再煮5~15 min,也可在水中加入2﹪石炭酸煮沸5 min,加入0.02﹪甲醛,
4. 滅菌處理:滅菌后物品,按正常情況已屬無菌,從滅菌器中取出應(yīng)仔細(xì)檢查放置,以免再度污染.
(1) 物品取出,隨即檢查包裝的完整性,若有破壞或棉塞脫掉,不可作為無菌物品使用.
(2) 取出的物品,如為包裝有明顯的水浸者,不可作為無菌物品使用.
(3) 培養(yǎng)基或試劑等,應(yīng)檢查是否符合達(dá)到滅菌后的色澤或狀態(tài),未達(dá)到者應(yīng)廢棄.
(4) 啟閉式容器,在取出時應(yīng)將篩孔關(guān)閉.
(5) 取出的物品掉落在地或誤放不潔這處,或沾有水液,均視為受到污染,不可作為無菌物品使用.
(6) 取出的合格滅菌物品,應(yīng)存放于貯藏室或防塵柜內(nèi),嚴(yán)禁與未滅菌物品混放.
(7) 凡屬合格物品,應(yīng)標(biāo)有滅菌日期及有效期限.
(8) 每批滅菌處理完成后,記錄滅菌品名、數(shù)量、溫度、時間、操作者。
四、有毒有菌污物處理要求
微生物實驗所用實驗器材、培養(yǎng)物等未經(jīng)消毒處理,一律不得帶出實驗室。
1. 經(jīng)培養(yǎng)的污染材料及廢棄物應(yīng)放在嚴(yán)密的容器或鐵絲筐內(nèi),并隼中存放在指定地點(diǎn),待統(tǒng)一進(jìn)行高壓滅菌。
2. 經(jīng)微生物污染的培養(yǎng)物,必須經(jīng)
3. 染菌后的吸管,使用后放入5﹪煤酚皂溶液或石炭酸液中,最少浸泡24h(消毒液體不得低于浸泡的高度)再經(jīng)
4. 涂片染色沖洗片的液體,一般可直接沖入下水道,烈性菌的沖洗液必須沖在燒杯中,經(jīng)高壓滅菌后方可倒入下水道,染色的玻片放入5﹪煤酚皂溶液中浸泡24 h后,煮沸洗滌。做凝隼試驗用的玻片或平皿,必須高壓滅菌后洗滌。
5. 打碎的培養(yǎng)物,立即用5﹪煤酚皂溶液或石炭酸液噴灑和浸泡被污染部位,浸泡半小時后再擦拭干凈。
污染的工作服或進(jìn)行烈性試驗所穿的工作服、帽、口罩等,應(yīng)放入專用消毒袋內(nèi),經(jīng)高壓滅菌后方能洗滌。
五、培養(yǎng)基制備要求
培養(yǎng)基制備的質(zhì)量將直接影響微生物生長。因為各種微生物對其營養(yǎng)要求不完全相同,培養(yǎng)目的的不同,各種培養(yǎng)基制備要求如下:
1. 根據(jù)培養(yǎng)基配方的成分按量稱取,然后溶于蒸餾水中,在使用前對應(yīng)用的試劑藥品應(yīng)進(jìn)行質(zhì)量檢驗。
2. PH測定及調(diào)節(jié):PH測定要在培養(yǎng)基冷至室溫時進(jìn)行,因在熱或冷的情況下,其PH有一定差異,當(dāng)測定好時,按計算量加入堿或酸混勻后,應(yīng)再測試一次。培養(yǎng)基PH值一定要準(zhǔn)確,否則會影響微生物的生長或影響結(jié)果的觀察。但需注意因高壓滅菌可影響一些培養(yǎng)基的PH降低或升高,故不宜滅菌壓力過高或次數(shù)太多,以免影響培養(yǎng)基的質(zhì)量,指示劑、去氧膽酸鈉、瓊脂等一般在調(diào)完P(guān)H后再加入。
3. 培養(yǎng)基需保持澄清,便于觀察細(xì)菌的生長情況,培養(yǎng)基加熱煮沸后,可用脫脂棉花或絨布過濾,以除去沉淀物,必要時可用雞蛋白澄清處理,所用瓊脂條要預(yù)先洗凈涼干后使用,避免因瓊脂含雜質(zhì)而影響透明度。
4. 盛裝培養(yǎng)基不宜用鐵、銅等容器,使用洗凈的中性硬質(zhì)玻璃容器為好。
5. 培養(yǎng)基的滅菌既要達(dá)到完全滅菌目的,又要注意不因加熱而降低其營養(yǎng)價值,一般
6. 每批培養(yǎng)基制備好后,應(yīng)做無菌生長試驗及所檢菌株生長試驗。如果是生化培養(yǎng)基,使用標(biāo)準(zhǔn)菌株接種培養(yǎng),觀察生化反應(yīng)結(jié)果,應(yīng)呈正常反應(yīng),培養(yǎng)基不應(yīng)貯存過久,必要時可置
7. 目前各種干燥培養(yǎng)基較多,每批需用標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行生長試驗或生化反應(yīng)觀察,各種培養(yǎng)基用相應(yīng)菌株生長試驗良好后方可應(yīng)用,新購進(jìn)的或存放過久的干燥培養(yǎng)基,在配制時也應(yīng)測PH,使用時需根據(jù)產(chǎn)品說明書用量和方法進(jìn)行。
8. 每批制備的培養(yǎng)基所用化學(xué)試劑、滅菌情況及菌株生長試驗結(jié)果、制作人員等應(yīng)做好記錄,以備查詢。
六、樣品采集及處理要求
1. 所采集的檢驗樣品一定要具有代表性,采樣時應(yīng)首先對該批食品原料、加工、運(yùn)輸、貯藏方法條件、周圍環(huán)境衛(wèi)生狀況等進(jìn)行詳細(xì)調(diào)查,檢查是否有污染源存在。
2. 根據(jù)食品的種類及數(shù)量,采樣數(shù)量及方法應(yīng)按標(biāo)準(zhǔn)檢驗方法的要求進(jìn)行。
3. 采樣應(yīng)注意無菌操作,容器必須滅菌,避免環(huán)境中微生物污染,容器不得使用煤酚皂溶液,用新潔爾滅、酒精等消毒藥物滅菌,更不能含有此類消毒藥物或抗生素類藥物,以避免殺死樣品中的微生物,所用剪、刀、匙用具也需滅菌方可應(yīng)用。
4. 樣品采集后應(yīng)立即送往檢驗室進(jìn)行檢驗,送檢過程中一般不超過3h,如路程較遠(yuǎn),可保存在1~
5. 檢驗室收到樣品后,進(jìn)行登記(樣品名稱、送檢單位、數(shù)量、日期、編號等),觀察樣品的外觀,如果發(fā)現(xiàn)有下列情況之一者,可拒絕檢驗。
(1) 樣品經(jīng)過特殊高壓、煮沸或其他方法殺菌者,失去代表原食品檢驗意義者。
(2) 瓶、袋裝食品已啟開者,熟肉及其制品、熟禽等食品已折碎不完整者,即失去原食品形狀者(食物中毒樣品除外)。
(3) 按規(guī)定采樣數(shù)量不足者。
對送檢符合要求的樣品,檢驗室收到后,應(yīng)立即進(jìn)行檢驗,如果條件不具備,應(yīng)置
6. 樣品檢驗時,根據(jù)其不同性狀,進(jìn)行適當(dāng)處理。
(1) 液體樣品接種時,應(yīng)充分混合均勻,按量吸取進(jìn)行接種。
(2) 固體樣品,用滅菌刀、剪取其不同部位共
(3) 瓶、袋裝食品應(yīng)用滅菌操作啟開,根據(jù)性狀選擇上述方法處理后接種。
七、樣品檢驗、記錄和報告的要求
1. 檢驗室收到樣品后,首先進(jìn)行外觀檢驗,及時按照國家標(biāo)準(zhǔn)檢驗方法進(jìn)行檢驗,檢驗過程中要認(rèn)真、負(fù)責(zé)、嚴(yán)格進(jìn)行無菌操作,避免環(huán)境中微生物污染。
2.樣品檢驗過程中所用方法、出現(xiàn)的現(xiàn)象和結(jié)果等均要用文字寫出試驗紀(jì)錄,以作為對結(jié)果分析、判定的依據(jù),記錄要求詳細(xì)、清楚、真實、客觀、不得涂改和偽造。